Ⅰ 怎样筛选可降解工业塑料的微生物菌种
首先是土壤的选择，可以到塑料厂或者垃圾场去收集一些土壤，然后碾碎用无菌水搅匀。
主要是培养基，可以将常用培养基改成以要降解物为唯一碳源或氮源的培养基进行培养，这样，不能降解的菌就不能生长，只有可以降解吸收这种碳源或氮源的微生物才能生长。当然，这个培养基的配置也需要试验一下
Ⅱ 分离筛选微生物菌种的基本程序
流程
4.1 优良糖化酶菌株的分离与筛选
融化培养基→倒平板→打散孢子团粒→梯度稀释→涂布平板→培养观察→滴加碘液→挑菌落→接种→培养→糖化酶活力测定→菌种保存
4.2 酸乳制品中的乳酸菌的分离
制培养基→倒平板→梯度稀释→涂布平板→培养观察→挑菌落→接牛乳管→培养观察→传代培养→挑选凝乳管→乳酸测定→菌种保存
5 步骤
5.1 优良糖化酶菌株的分离与筛选
（1）融化淀粉察氏培养基，稍冷后倒平板与斜面数个。
（2）取种曲少许，加入10mL带玻璃球的无菌生理盐水的三角瓶中，用力振荡打散孢子团粒，使之形成均匀的孢子悬浮粒。然后将其用无菌纱布过滤于无菌试管中。
（3）将上述滤液以10倍稀释法知释至10-7，取后3个稀释度的稀释液各0.2mL，于淀粉察氏培养基平板上用无菌涂布器分别依次涂布2至3个皿，30℃培养1~2d。
（5）性能测定：测定各菌落的糖化酶活力。
5.2 酸乳制品中的乳酸菌的分离
（1）制备BCG牛乳营养琼脂培养基。
①称取脱脂奶粉10g，溶于50mL水中，加入1.6%溴甲酚绿酒精溶液0.07mL，0.075MPa压力下灭菌20min。
②另取琼脂2g，溶于50mL水中，加酵母膏1g，溶解后调pH值至6.8，0.1MPa压力下灭菌20min。
③趁热将上述两液以无菌操作混合均匀，倒平板6个，待凝固后，置37℃培养24h，若无杂菌生长，即可使用。
（2）将样品以10倍稀释法稀释至10-7，取其中10-7、10-6 2个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL，分别置于上述各营养平板上，用无菌涂布器依次涂布2至3个皿，置43℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基亦为黄色者初步定为乳酸菌。
（3）将典型菌落转至脱脂乳发酵管，43℃培养8~24h，若牛乳管凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色呈阳性，则将其连续传代若干次，43℃培养，挑选出在3~4h能凝固的乳管，保存备用。
（4）乳酸菌的鉴定及生物量的测定。
Ⅲ 如何进行生产菌的分离和筛选
（3）从一些发酵制品中分离目的菌株。 菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株，为使筛选达到事半功倍的效果，从中筛选所需菌株。
（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选，如从酱油中分离蛋白酶产生菌：
（1）向菌种保藏索取有关的菌株，总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
在实验工作中工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株、分离、产物鉴别几个步骤
Ⅳ 工业微生物菌株的来源途径主要有哪些、
（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株,从中筛选所需菌株.
（2）由自然界采集样品,如土壤、水、动植物体等,从中进行分离筛选.
（3）从一些发酵制品中分离目的菌株,如从酱油中分离蛋白酶产生菌,从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等.该类发酵制品经过长期的自然选择,具有悠久的历史,从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株.
Ⅳ 功能微生物筛选过程及应用价值
菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。 ? {cF'RB.
在实验工作中，为使筛选达到事半功倍的效果，总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选： 4jis\W}%L3
（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 ^5u}
（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。 O|%><I?I
（3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。 r N$_(%m_N
菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。 8*4X%a=O f
第一节 含微生物样品的采集 Q?7U iTZ
自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多。 G+^HZ4jg
一、从土壤中采样 $0D]d.w=
土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 M*8Ef^-U`t
（一）根据土壤特点 8_8 R$ =V
1．土壤有机质含量和通气状况 &'c1"%*%8>
一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。 VCNg`6!x
从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比5～25cm土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样最好的土层是5～25cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅，约5～10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。 \@GA;~x.b
2.土壤酸碱度和植被状况 -fT]}T6=
土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤（pH7.0～7.5）环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。由于植物根部的分泌物有所不同，因此，植被对微生物分布也有一定的影响。如番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌。葡萄或其他果树在果实成熟时，其根部附近土壤中酵母菌数量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌数量比其他植被下占优势。 m:)v>vu
3．地理条件 bh3}[O,L A
南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多，特别是热带和亚热带地区的土壤。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方土壤中筛选出来。原因是南方温度高，温暖季节长，雨水多，相对湿度高，植物种类多，植被覆盖面大，土壤有机质丰富，造成得天独厚的微生物生长环境。 +0;6.PK
4．季节条件 75jq+O_:
不同季节微生物数量有明显的变化，冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少。到了春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加。但就南方来说，春季往往雨水多，土壤含水量高，通气不良，即使有微生物所需的温度、湿度，也不利于其生长繁殖。随后经过夏季到秋季，约有7～10个月处在较高的温度和丰富的植被下，土壤中微生物数量比任何时候都多，因此，秋季采土样最为理想。 /3L1Un*
（二）采样方法 zVd2kuI&?
用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25处的土样10～25，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取3～4撒到试管斜面上，这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。 &Op, ?\
二．根据微生物生理特点采样 w byY? tH
1.根据微生物营养类型 %r=uS.+hrF
每种微生物对碳\氮源的需求不一样,分布也有差异。研究表明，微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。如森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长；在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在，因而，在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌；在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所，容易分离到产生蛋白酶、糖化酶的菌株。若要筛选以糖质为原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样。在筛选果胶酶产生菌时，由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有较多的果胶，因此，从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的结果。在油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株。Hartman等人曾从乙烯氯化物的工厂附近分离到一株以乙烯氯化物为碳源和能源的分枝杆菌。含1%乙烯氯化物的空气通过该菌培养可除去93%的毒性。也有人从含油污泥中筛选出能以20#机械润滑油为惟一碳源的3株石油降解菌菌株，分别为动胶菌属（Zoogloea sp.）、氮单胞菌属（Azomonas sp.）和假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。当然，也可将一种需要降解的物质作为样品中微生物的惟一碳源或氮源进行富集，然后分离筛选。 X2}\i5{
此外，不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉或其他糖类物质获得能源而生长。以石油等碳氢化合物为碳源的油田微生物，也可以利用一些糖类为碳源。具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他样品中也会存在。不过数量较少。 \ ExM.T
2.根据微生物的生理特性 w-C ~ Ik
在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。如筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、深海中采样；分离耐压菌则通常到海洋底部采样。因为深海中生活的微生物能耐很高的静水压，如从海中筛到一株水活微球菌（Micrococcus aquivivus）,它能在600个大气压下生长。分离耐高渗透压酵母菌时，由于其偏爱糖分高、酸性的环境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌。 AE={P*g
三、特殊环境下采样 @{iws@.
1．局部环境条件的影响 jr bEJ.
值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和环境条件综合因素的影响之外，还要受局部环境条件的影响。如北方气候寒冷，年平均温度低，高温微生物相对较少。但在该地区的温泉或堆肥中，却会出现为数众多的高温微生物。氧气充足的土层中按理只适合于好氧菌生长，实际上也有一些嫌气菌生活，原因是好气菌生长繁殖消耗了土层中大量氧气，为嫌气菌创造了局部生长的有利环境，故一般土壤中也能分离到嫌气菌。 X/ gIH/
海洋对于微生物来说是一个特殊的局部环境，尽管许多微生物也是经河水、污水、雨水或尘埃等途径而来，但由于海洋独特的高盐度、高压力、低温及光照条件，使海洋微生物具备特殊的生理活性，相应也产生了一些不同于陆地来源的特殊产物。前苏联学者发现，20%～50%的海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物。此外，美国马里兰大学也曾从海绵体内的共生或共栖的细菌中分离到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物质。日本发现深海鱼类肠道内的嗜压古细菌，80%以上的菌株可以生产EPA 和DHA，最高产量可达36%和24%。笔者从鳕鱼肠道中分离到一株pj20细菌，产EPA14.78mg/L，在15℃培养时EPA占脂肪酸的12.7%。日本也从海洋Thraustochvtrium aureum中筛选到一株产DNA达290mg/L的菌株。从海洋中采样时，可参考其中不同种类微生物的分布规律：表层多为好气异养菌，底层由于有机质丰富，硫化氢含量高，厌气性腐败菌和硫酸盐还原菌较多，两层中则多为紫硫菌。 u_;*Ay
具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中。如得克萨斯州中南部的一个岩洞中存在着大量嗜碱性的，能进行氨氧化和产几丁质酶的微生物，其原因是这里生活这2000万只蝙蝠，它们每晚吃钓5万lb（磅）昆虫，其排泄物造成了洞内0m深的丰富营养层，这种特殊的环境对该种微生物起了选择和富集的作用。还有人从侵蚀木船的一种蠕虫肠道中分离到既能固氮又能降解纤维素的微生物。从考拉(Koala)熊肠中也曾分离到萜烯分解酶的产生菌，这可能因为考拉专吃含有高萜烯的桉树类植物，给该种微生物创造了一个适宜的生长环境。美国从用硝酸处理过的花生壳中分离到一株节杆菌，该菌以木质素为唯一碳源，它对处理过的花生壳的消化率可达到63%，再加入酿酒酵母使其蛋白质含量达到13.6%，可作为牛、猪、鸡饲料的添加剂。 |NJe4lw+?
2．极端环境条件的影响 MqGF~h|+
微生物一般在中温、中性pH条件下生长。但在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下，也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端微生物。生活所处的特殊环境，导致它们具有不同与一般微生物的遗传特性、特殊结构和生理机能，因而在冶金、采矿及生产特殊酶制剂方面有着巨大的应用价值。 Z.a m^Q^Y!
嗜冷菌（thermophiles）的最适生长温度为15℃，在0℃也可生长繁殖，最高温度不超过20℃。主要分布于寒冷的环境中，如南北两极地区、冰窟、高山、深海和土壤等低温环境中。这类微生物在低温发酵时可生产许多风味食品且可节约能源及减少中温菌的污染。最适生长pH在8.0以上，通常在pH9～10之间的微生物，称之为嗜碱菌（alkaliphiles）。大量不同类型的嗜碱菌已经从土壤、碱湖、碱性泉甚至海洋中分离得到。由于大部分碱湖伴有高盐，许多嗜碱菌同时也是嗜盐菌。该类菌所产生的酶如耐碱蛋白酶和碱性纤维素酶可作为洗涤剂的舔加成分，也可将碱性淀粉酶用于纺织品工业。嗜碱菌中的基因还可以用来调节其他细菌中基因产物的表达和分泌。嗜热微生物是嗜热菌最好的来源。有人从温泉和海底火山口分离出了极端嗜热菌。从意大利境内的喷硫磺气的火山口中分离到一种原始的微生物，在pH2和90℃时生长最好，其代谢类型极不寻常，既能作为耗氧型自养菌将硫氧化成硫酸，使自己增殖，又能作为厌氧菌用氢还原硫，生成H2S。 l=8)_z;~D
第二节 含微生物样品的富集培养 $#2ik~]>
富集（enrichment）培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。 v_)a=I%o&2
富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。一般可从以下几个方面来进行富集。 ;Z HKTOoK
一、控制培养基的营养成分 )67_ yHW
微生物的代谢类型十分丰富，其分布状态随环境条件的不同而异。如果环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该物质的微生物也较多。因此，在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。当然，能在该种培养基上生长的微生物并非单一菌株，而是营养类型相同的微生物群。富集培养基的选择性只是相对的，它只是微生物分离中的一个步骤。 sDT(3{)L7
现举两例，如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源，加入含菌样品，给目的微生物以最佳的培养条件（pH、温度、营养、通气等）进行培养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源无法生长，菌数逐渐减少。此时分离将得到所需的微生物。又如要分离耐高渗酵母菌，由于该类菌在一般样品中含量很少，富集培养基和培养条件必须严密设计。首先要到含糖分高的花蜜、糖质中去取样。富集培养基为5%～6%的麦牙汁，30%～40%葡萄糖，pH3～4，在20～25℃温度下进行培养，可以达到富集的目的。 , mEFp_a+
在富集培养时，还需根据微生物的不同种类选用相应的富集培养基，如淀粉琼脂培养基通常用于丝状真菌的增殖，配方为（%）：可溶性淀粉4，酵母浸膏0.5，琼脂2，pH6.5～7.0。在配制时要特别注意酵母浸膏加量，过多会刺激菌丝生长，而不利于孢子的产生。 Y:[W wX|
根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点，可通过连续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌。如以苯胺作惟一碳源对样品进行富集培养，待底物完全降解后，再以一定接种量转接到新鲜的含苯胺的富集培养液中，如此连续移接培养数次。同时将苯胺浓度逐步提高，便可得到降解苯胺占优势的菌株培养液，采用稀释涂布法或平板划线法进一步分离，即可得到能降解高浓度苯胺的微生物。移种的时间既可根据底物的降解情况，也可通过微生物的生长情况确定。如在分离环己烷降解菌时，样品经环己烷为惟一碳源的培养基富集后，培养液由原来的无色变为浑浊的乳白色。同时锥行瓶壁上也可观察到微生物的生长情况。此时可以2%的接种量移入新鲜的富集培养基中继续培养。连续富集培养的方法虽耗时较长，有时甚至需要6～7个月，但效果较好。通过该方法分离DDT、甲基对硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌，也都取得了满意的结果。 W6ZXb_ X
二、控制培养条件 OSk:njyC[
在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～7.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）。因此，富集培养基的pH值调节到被分离微生物的要求范围不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。 P1;T- .X~&
分离放线菌时，可将样品液在40℃恒温预处理20分钟，有利于孢子的萌发，可以较大的增加放线菌数目，达到富集的目的。 ,cPNZ-%
筛选极端微生物时，需针对其特殊的生理特性，设计适宜的培养条件，达到富集的目的。 3p{N7/z(
一般所筛选的微生物通常是好氧菌，但有时也需分离厌氧菌。因严格厌氧菌不仅可省略通气、搅拌装置，还可节省能耗。这时除了配置特殊的培养基外，还需准备特殊的培养装置，创造一个有利于厌氧菌的生长环境，使其数量增加，易于分离。 WJ=DTO N
三、抑制不需要的菌类 vA@K b3 ,
在分离筛选的过程中，除了通过控制营养和培养条件，增加富集微生物的数量以有利于分离外，还可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。 Kdh(vNB>
从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性，100℃很难杀死，要在121℃才能彻底死亡。可先将土样加热到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离。在富集培养基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性无抑制作。分离厌氧菌时，可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂，它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。 9+"D8 J7
筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌，使霉菌在样品的比例提高，从中便于分离到所需的菌株；分离放线菌时，在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌）各30～50U/ml，以及丙酸钠10μg/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长。另外据报道，重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，也可用于选择分离放线菌。在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到100℃保温1h，可减少细菌和链霉菌的数量。分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间，杀死非目的微生物后再进行分离。 LO]D XW 9
对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集培养以提高分离工作效率是十分必要的。但是如果按通常分离方法，在培养基平板上能出现足够数量的目的微生物，则不必进行富集培养，直接分离、纯化即可。 3{RuR+yi
第三节 微生物的分离 }uo5rB5D
经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。例如同样一群以油脂为碳源的脂肪酶产生菌，有的是细菌，有的是霉菌，有的是芽孢杆菌，有的不产芽孢，有的生产能力强，有的生产能力弱等等。因此，经过富集培养后的样品，也需要进一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。 Mm`jk%:%]
Ⅵ 选择性分离微生物育种的步骤大致有哪些
一、微生物工业对菌种的要求
(一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。
（二）、微生物工业对菌种的要求是：
（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;
（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;
（3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;
（4）能够高效地将原理转化为产品;
（5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小;
（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;
（7）在发酵过程中产生的泡沫要少;
（8）具有抗噬菌体的能力；
（9）遗传稳定性，
二、工业用微生物菌种的来源及选育
（一）微生物菌种的来源
一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：
（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；
（2）从大自然中采集样品分离；
（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。
当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
（二）微生物工业菌种的分离
1、野生菌株的分离、筛选过程
（1）新菌种分离与筛选的步骤
菌种分离的流程如下：
标本采集 →标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→ 菌种复筛→性能鉴定→ 菌种保藏
①采样
采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
②标本预处理
④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。
⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定，
⑥毒性试验：据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。
2、菌种的分离方法
（1）施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
（2）随机分离方法
有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。
A、抗生素产生菌的分离
抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。
Ｂ、抗肿瘤药物产生菌的分离
抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。
B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。
B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。
Ｃ、生长因子产生菌的分离
以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中。
Ⅶ 工业微生物菌株的来源途径主要有哪些、
（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。
（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。
（3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。
Ⅷ 任选一种感兴趣的重要工业微生物发酵产品，利用已学的理论知识，试述该生产菌株的筛选方案。帮帮忙，谢谢
选一种你感兴趣的微生物，比如说分解石油的，或者能源微生物等，以分解石油的为例，
首先：自然筛选，从石油污染的水源或者不同石油浓度培养的微生物中分离，筛选。查找资料，看看那种微生物可能分解石油，是细菌，杆菌，霉菌还是什么，有针对性地根据微生物的大小，培养特点，抗性等分离得到基础分解石油的微生物，在培养基上进行但菌落的分离
之后：建立行之有效的检测机制，例如可以以石油分解率为指标等
第三：诱变育种，将上述基础微生物进行诱变，可采用化学诱变，放射性诱变等方法，之后挑取每一个单菌落进行检测
第四：基因育种，通过查找文献的方法找到控制分解石油的基因进行分子克隆重组，如果没有该功能基因的报道，亦可以自己分离，方法是采用SSH等表达差异分析方法，找到你诱变出来的优秀菌株与突变菌株的差异基因片段，分析该差异基因片段的可能功能，找出可能的功能基因，同样进行表达载体的构建，转化基础菌株，看看是否能够提高分解速度
第五：代谢调控育种：根据分解石油可能的代谢网络，加入抑制剂等打断该菌其他的代谢途径，促进分解石油的代谢途径，同时研究最佳的分解石油的温度，PH，所需离子等条件
我不是专业的，你大致的看一下，希望有帮助
Ⅸ 论述从环境中筛选目标菌中的方法，一种就可以，详细点
5.6 菌种筛选方法
所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。 为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。因为诱变育种中的筛选工作最复杂，所以，本节主要讨论诱变育种的筛选方法，这些方法也为其它育种方法的筛选提供了借鉴。
5.6.1菌种筛选方案 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。
5.6.2 菌种筛选的手段 筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求，对于初筛，要力求快速、简便，对于复筛，应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平。
5.6.2.1 从菌体形态变异分析 有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。
5.6.2.2 平皿快速检测法 平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。 图 5.6.1 平皿快速检测法示意图 平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。
1) 纸片培养显色法 将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。
2) 变色圈法 将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。
3) 透明圈法 在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。 在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。
4) 生长圈法 利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。 该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。
5) 抑制圈法 待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。例如：将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，以避免其它因素干扰，移入无培养基平皿，继续培养4-5天，使抑制物积累，此时的抑制物难以渗透到其它地方，再将其移入涂布有工具菌的平板，每个琼脂块中心间隔距离为2厘米，培养过夜后，即会出现抑菌圈。抑菌圈的大小反映了琼脂块中积累的抑制物的浓度高低。该法常用于抗生素产生菌的筛选，工具菌常是抗生素敏感菌。由于抗生素分泌处于微生物生长后期，取出琼脂块可以避免各菌落所产生抗生素的相互干扰。典型的例子是春雷霉素生产菌的筛选，见图5.6.2。
5.6.2.3 摇瓶培养法 摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。摇瓶与发酵罐的条件较为接近，所测得的数据就更有实际意义。但是摇瓶培养法需要较多的劳力、设备和时间，所以，摇瓶培养法常用于复筛。但若某些突变性状无法用简便的形态观察或平皿快速检测法等方法检测时，摇瓶培养法也可用于初筛。 初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。
5.6.3 特殊变异菌的筛选方法 上述一般的筛选菌株方法的处理量仍是很大的，为了从存活的每毫升106左右细胞的菌悬液中筛选出几株高产菌株，要进行大量的稀释分离、摇瓶和测定工作。虽然平皿快速检测法作为初筛手段可减少摇瓶和测定的工作量，但稀释分离的工作仍然非常繁重。而且有些高产变异的频率很低，在几百个单细胞中并不一定能筛选到，所以，建立特殊的筛选方法是极其重要的。例如营养缺陷型和抗性突变菌株的筛选有它们的特殊性，营养缺陷型或抗性突变的性状就象一个高效分离的"筛子"，以它为筛选的条件，可以大大加快筛选的进程并有效地防止漏筛。在现代的育种中，常有意以它们作为遗传标记选择亲本或在DNA中设置含这些遗传标记的片段，使菌种筛选工作更具方向性和预见性。本节还将简单介绍其它一些特殊变异株的筛选方法。
5.6.3.1营养缺陷型突变株的筛选 经诱变处理后的菌悬液在筛选前一般应先进行诱变后培养，以促使变异细胞发生分离，防止出现表型延迟现象，筛选出不纯的菌株。营养缺陷型的筛选一般包括浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。
1) 浓缩营养缺陷型菌株 诱变后的细胞群体中大部分存活菌是野生型，而营养缺陷型占的比例相当小，这对分离是很不利的，所以，应该淘汰大量的野生型，以达到浓缩营养缺陷型的目的。常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。
2)进一步检出所需缺陷型 浓缩后的菌液中营养缺陷型的比例较大，但并非全部都是。并且营养缺陷型中也有不同的类型，还需要进一步检出所需要的营养缺陷型。这样就需要采用逐个检出法、夹层培养法和限量补给法等方法进一步检出所需要的营养缺陷型。
3)营养缺陷型的鉴定 获得的营养缺陷型菌株还应进一步确认其生长的所需物。菌株较少时，可用生长谱法， 若菌株较多时，常采用组合补充培养基法
5.6.3.2 抗性突变菌株的筛选 抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10-6频率的突变体存在，就容易筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。
1) 一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。 噬菌体抗性菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。 耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。耐高温菌株也常采用此法筛选。将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。 耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。
2)阶梯性筛选法 药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物来一次性筛选，大量细胞中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。 因为药物抗性常受多位点基因的控制，所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经"驯化"或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏，所以说，阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下
5.6.3.3 组成酶变异株的筛选
许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）往往会引起酶合成的减少，诱导物有时又比较昂贵。这些都可能造成这些水解酶工业生产的波动以及生产成本提高。如果控制这些酶合成的调节基因发生了变异，诱导酶就可能转变成组成酶，它的合成与细胞的其它组织蛋白一样，不再需要诱导物的存在。由诱导型的出发菌株诱变筛选出组成型变异株对于水解酶的工业生产具有重要的现实意义。具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法。
1) 恒化器法 恒化器常被用于微生物的"驯化"。在培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，接入处理后的菌悬液进行培养，此时出发菌株由于不能被诱导，无法合成有关的诱导酶而不能分解该底物，从而生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速率较快。为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中的比例，可以应用恒化器培养技术。随着恒化器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大组成酶变异株的优势，这样就能够比较容易地做进一步的纯化分离。
2) 循环培养法 利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的培养基中时，两种类型菌株同样能较好地生长，但在此环境中组成型突变株已能合成有关的水解酶，而诱导型菌株就不能合成。 进而将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段，两类菌株的生长就不同步了，随着循环交替培养的继续，组成酶变异株所占的比例将逐渐增大。
3) 诱导抑制剂法 有些化合物能阻止某些诱导酶的合成，如α-硝基苯基-β-岩藻糖苷对大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的诱导合成有抑制作用，称为诱导抑制剂。当在诱导物和诱导抑制剂同时存在的培养环境中培养待分离菌群时，诱导型菌株不能产生诱导酶，无法正常生长，只有组成型变异株能够利用底物进行生长繁殖。
5.6.3.4高分子废弃物分解菌的筛选 随着石油化工和塑料工业的发展，各种高分子包装废弃物日益增多，这些"白色污染"在自然界很难被消化而进入物质循环。设法选育能分解利用这些高分子材料的微生物对于环境保护至关重要。这些高分子材料大多是不溶于水的，直接分离具有分解功能的微生物很困难。为此，有人设计了阶段式筛选法，首先寻找能在与聚乙二醇结构相似的含两个醚键的三甘醇上生长的微生物，接着，诱变筛选能分解聚乙二醇的变异株；或者筛选能以乙二醇、丙二醇为碳源的菌株，继而诱变筛选出能利用聚乙二醇等物质的变异株。这种由简单的聚合物单体入手逐级筛选高分子废弃物分解菌也许是一条有效的筛选思路。
5.6.3.5无泡沫菌株及高凝聚性菌株的筛选 有些菌在发酵过程中会产生大量的泡沫，从而造成发酵液满溢，增大了染菌的机会，使发酵体系反应不均匀，也有可能引起某些发酵产物的生物活性丧失，如蛋白酶变性失活。为了避免泡沫的产生，常常需通过牺牲发酵液的装量或加入大量的消泡剂来消除泡沫的不利影响。发酵过程产生泡沫是菌体代谢、培养基和发酵工艺等方面的原因造成的，而菌种是产生泡沫的关键，选育无泡沫或少泡沫菌株可以从根本上解决泡沫问题。 有人用气泡上浮法筛选出了无泡沫的酒精酵母。将变异处理后的菌悬液接种入生长培养基中，培养器皿的底部放置无菌压缩空气喷口，培养过程中不断通入无菌空气，形成鼓泡，易产生泡沫的酵母菌会随泡沫而除去，留下的是不易产生泡沫的变异菌株；也有人用苯胺蓝染色法进行筛选，将经过变异处理的菌悬液经培养后涂布在含葡萄糖3%、酵母膏0.5%、苯胺蓝0.005%的平板上培养4天，出发菌株呈浅蓝色，变异菌株因细胞壁成分和结构改变造成与染料结合力改变，少泡沫的变异菌株呈深蓝色。 啤酒发酵和单细胞蛋白培养都希望由凝聚性较好的酵母菌株担任发酵菌种，以便于啤酒的澄清和保持良好的风味，以及单细胞蛋白的收集。采用上述的泡沫上浮法也可以除去不易凝聚的细胞，通过改变鼓泡速度的调节，可以获得具不同凝聚性的菌株。