工业化生产如何控制真菌接种量

‘壹’ 工业化生产乳酸菌的液体培养基的配方

1材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌种：鸡源乳酸菌（本研究所分离、鉴定保存）
1.1.2原材料及试剂：酵母粉、葡萄糖、玉米糖浆、微量盐及其他特殊成分；MRS液体培养基，琼脂粉，5NNaOH溶液
1.1.3仪器及设备：三角烧瓶、二重皿、全温振荡培养箱、高压消毒锅、微量移液器、全自动发酵罐等。
1.2方法
1.2.1种子液准备：
取出菌种保藏管用MRS固体培养基划平板进行复苏，37度厌氧培养48h。在平皿上挑取单个菌落接种50mlMRS液体培养基中，在摇床中37度厌氧培养48h。染色、镜检种子液，观察菌体生长情况及有无杂菌生长。
1.2.2正交试验培养基配制；
根据细菌组成的碳氮比来确定原材料的浓度配比，选择5种原材料，确定4个浓度，采用正交表L16（45）共安排16次试验，每个试验配培养基各100ml，调整pH值置150ml三角瓶中消毒，备用。
1.2.3接种与培养：
正交试验种子采用2％接种量，接种后置三角瓶与37度震荡培养。每8h调一次pH值，培养36h用梯度稀释和平板涂布法检测活菌数。
1.2.4发酵中试：
根据正交试验结果，确定配方，采用150升种子罐和1.5吨发酵罐进行中试，培养温度37度，转速120-150转／min，培养时间36-48h，用梯度稀释和平板涂法检测活菌数。
2 结果
2.1通过正交试验，培养36h用梯度稀释和平板涂布法检测活菌数，获得活菌数为70亿／ml、67亿／ml、和66亿／ml的配方。
2.2用3＃配方作为大规模中试发酵培养基在全自动发酵罐不中厌氧培养36h，结果活菌数为100～120亿／ml
3 讨论
3.1 本试验采用了正交试验设计法对培养基的原材料进行筛选，该方法能利用有限的试 验获得正确、全面的试验结果，加快了实验进程。
3.2通过正交试验和发酵中试，活菌数超过了实验室培养的菌数，使基质转化率达到35％，降低了生产成本。
工业培养基跟实验室培养基的区别:
只是说原料粗糙度或者说是原料选择的区别，品级不一样而已，要看对于乳酸菌培养的要求了，比如要看是做高密度培养呢，还是直接就获取代谢产物，菌体离心收集后洁净度是否要高，还有就是选择的工艺是否时候使用低品级的工业培养基呢，这些问题需要综合考虑才能最后定论培养基的内容。

‘贰’ 菌种生产的要求有哪些

（一）细菌实验室细菌实验室是进行细菌学实验的场所。标本的接种、培养、分离、鉴定及药敏试验等工作都要在此完成。所以细菌室应该符合一定的条件。1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。且室内禁用风扇，避免细菌的播散。2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min。对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗l次。5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。同时室内应设置必要的消防设备。（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。5.条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。超净工作台应选择垂直气流通风方式。6.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。（三）基本设备和器具细菌实验室内必须具备的设备和器具有：用于细菌培养的温箱、C02培养箱、厌氧培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计；细菌检验操作时用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。

‘叁’ 如何利用微生物的生长规律来指导工业生产

1．缩短延滞期
在工业发酵和科学研究中，延滞期将延长生产周期而降低设备的利用率，通常采用一定的措施来缩短延滞期：
① 用遗传学方法改变菌种的遗传特性，使该菌延滞期缩短；
② 采用指数生长期的健壮菌种接种培养，可以缩短乃至消除延滞期；
③ 尽量使发酵培养基的组成接近种子培养基，并且适当丰富些，或在种子培养基中加入发酵培养基的成分，实验证实，接种到营养丰富的天然培养基中的微生物比接种到营养单调的组合培养基中的延滞期短；
④ 适当增加接种量，发酵工业上通常采用V种子：V培养基＝1∶20，最多达1∶10，利用较大的接种量以缩短甚至消除延迟期。
2．把握对数期
对数期期间，菌数增加最快，生长速率最大，在发酵工业中通过连续流加或补加发酵原料，使菌体随着营养浓度增加而提高生长速率，可以获得更多的菌体。
3．延长稳定期
微生物处于稳定期的长短与菌种特性和环境条件有关，在发酵工业中为了获得更多的菌体或代谢产物，还可以通过补料，调节pH值、温度或通气量等措施来延长稳定期。向发酵体系中连续流加营养物、移走代谢产物的培养方式即为连续培养。
微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为微生物的初级代谢是释放生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢生成的中间产物称为初级代谢产物，如氨基酸、核苷酸、乙醇等，它们对微生物的生存是必需的，各种微生物产生种类相似的初级代谢产物，并且这些产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步。在微生物分批培养过程中，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机。另有一些代谢产物与微生物的生存、生长和繁殖无关，称为次级代谢产物，如抗生素、生长激素、生物碱、维生素、色素和毒素等。这些代谢产物的形成过程往往与微生物细胞生长过程不同步。在分批培养中，它们形成的高峰往往在微生物生长的稳定期后期或衰亡期。通过连续培养等方式，可以延长稳定期，提高次级代谢物的产量。
4．监控衰亡期
工业发酵中尽量阻止衰亡期的到来，但出现衰亡期是不可避免的，一旦进入衰亡期，积累的微生物代谢毒物可能与代谢产物发生反应或影响提纯，必须在合适的时候结束发酵。