Ⅰ 怎樣篩選可降解工業塑料的微生物菌種
首先是土壤的選擇，可以到塑料廠或者垃圾場去收集一些土壤，然後碾碎用無菌水攪勻。
主要是培養基，可以將常用培養基改成以要降解物為唯一碳源或氮源的培養基進行培養，這樣，不能降解的菌就不能生長，只有可以降解吸收這種碳源或氮源的微生物才能生長。當然，這個培養基的配置也需要試驗一下
Ⅱ 分離篩選微生物菌種的基本程序
流程
4.1 優良糖化酶菌株的分離與篩選
融化培養基→倒平板→打散孢子團粒→梯度稀釋→塗布平板→培養觀察→滴加碘液→挑菌落→接種→培養→糖化酶活力測定→菌種保存
4.2 酸乳製品中的乳酸菌的分離
制培養基→倒平板→梯度稀釋→塗布平板→培養觀察→挑菌落→接牛乳管→培養觀察→傳代培養→挑選凝乳管→乳酸測定→菌種保存
5 步驟
5.1 優良糖化酶菌株的分離與篩選
（1）融化澱粉察氏培養基，稍冷後倒平板與斜面數個。
（2）取種曲少許，加入10mL帶玻璃球的無菌生理鹽水的三角瓶中，用力振盪打散孢子團粒，使之形成均勻的孢子懸浮粒。然後將其用無菌紗布過濾於無菌試管中。
（3）將上述濾液以10倍稀釋法知釋至10-7，取後3個稀釋度的稀釋液各0.2mL，於澱粉察氏培養基平板上用無菌塗布器分別依次塗布2至3個皿，30℃培養1~2d。
（5）性能測定：測定各菌落的糖化酶活力。
5.2 酸乳製品中的乳酸菌的分離
（1）制備BCG牛乳營養瓊脂培養基。
①稱取脫脂奶粉10g，溶於50mL水中，加入1.6%溴甲酚綠酒精溶液0.07mL，0.075MPa壓力下滅菌20min。
②另取瓊脂2g，溶於50mL水中，加酵母膏1g，溶解後調pH值至6.8，0.1MPa壓力下滅菌20min。
③趁熱將上述兩液以無菌操作混合均勻，倒平板6個，待凝固後，置37℃培養24h，若無雜菌生長，即可使用。
（2）將樣品以10倍稀釋法稀釋至10-7，取其中10-7、10-6 2個稀釋度的稀釋液各0.1~0.2mL，分別置於上述各營養平板上，用無菌塗布器依次塗布2至3個皿，置43℃培養48h，如出現圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養基亦為黃色者初步定為乳酸菌。
（3）將典型菌落轉至脫脂乳發酵管，43℃培養8~24h，若牛乳管凝固，無氣泡，呈酸性，鏡檢細胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色呈陽性，則將其連續傳代若干次，43℃培養，挑選出在3~4h能凝固的乳管，保存備用。
（4）乳酸菌的鑒定及生物量的測定。
Ⅲ 如何進行生產菌的分離和篩選
（3）從一些發酵製品中分離目的菌株。 菌株的分離和篩選一般可分為采樣、富集，從酒醪中分離澱粉酶或糖化酶的產生菌等。該類發酵製品經過長期的自然選擇，具有悠久的歷史，從這些傳統產品中容易篩選到理想的菌株，為使篩選達到事半功倍的效果，從中篩選所需菌株。
（2）由自然界採集樣品，如土壤、水、動植物體等，從中進行分離篩選，如從醬油中分離蛋白酶產生菌：
（1）向菌種保藏索取有關的菌株，總的說來可從以下幾個途徑進行收集和篩選，二是把分離到的野生型菌株進一步純化並進行代謝產物鑒別。
在實驗工作中工業微生物產生菌的篩選一般包括兩大部分：一是從自然界分離所需要的菌株、分離、產物鑒別幾個步驟
Ⅳ 工業微生物菌株的來源途徑主要有哪些、
（1）向菌種保藏機構索取有關的菌株,從中篩選所需菌株.
（2）由自然界採集樣品,如土壤、水、動植物體等,從中進行分離篩選.
（3）從一些發酵製品中分離目的菌株,如從醬油中分離蛋白酶產生菌,從酒醪中分離澱粉酶或糖化酶的產生菌等.該類發酵製品經過長期的自然選擇,具有悠久的歷史,從這些傳統產品中容易篩選到理想的菌株.
Ⅳ 功能微生物篩選過程及應用價值
菌株分離（separation）就是將一個混雜著各種微生物的樣品通過分離技術區分開，並按照實際要求和菌株的特性採取迅速、准確、有效的方法對他們進行分離、篩選，進而得到所需微生物的過程。菌株分離、篩選（screening）雖為兩個環節，但卻不能絕然分開，因為分離中的一些措施本身就具有篩選作用。工業微生物產生菌的篩選一般包括兩大部分：一是從自然界分離所需要的菌株，二是把分離到的野生型菌株進一步純化並進行代謝產物鑒別。 ? {cF'RB.
在實驗工作中，為使篩選達到事半功倍的效果，總的說來可從以下幾個途徑進行收集和篩選： 4jis\W}%L3
（1）向菌種保藏機構索取有關的菌株，從中篩選所需菌株。 ^5u}
（2）由自然界採集樣品，如土壤、水、動植物體等，從中進行分離篩選。 O|%><I?I
（3）從一些發酵製品中分離目的菌株，如從醬油中分離蛋白酶產生菌，從酒醪中分離澱粉酶或糖化酶的產生菌等。該類發酵製品經過長期的自然選擇，具有悠久的歷史，從這些傳統產品中容易篩選到理想的菌株。 r N$_(%m_N
菌株的分離和篩選一般可分為采樣、富集、分離、產物鑒別幾個步驟。 8*4X%a=O f
第一節 含微生物樣品的採集 Q?7U iTZ
自然界含菌樣品極其豐富，土壤、水、空氣、枯枝爛葉、植物病株、爛水果等都含有眾多微生物，種類數量十分可觀。但總體來講土壤樣品的含菌量最多。 G+^HZ4jg
一、從土壤中采樣 $0D]d.w=
土壤由於具備了微生物所需的營養、空氣和水分，是微生物最集中的地方。從土壤中幾乎可以分離到任何所需的菌株，空氣、水中的微生物也都來源於土壤，所以土壤樣品往往是首選的採集目標。一般情況下，土壤中含細菌數量最多，且每克土壤的含菌量大體有如下的遞減規律：細菌（108）>放線菌（107）>黴菌（106）>酵母菌（105）>藻類（104）>原生動物（103），其中放線菌和黴菌指其孢子數。但各種微生物由於生理特性不同，在土壤中的分布也隨著地理條件、養分、水分、土質、季節而有很大的變化。因此，在分離菌株前要根據分離篩選的目的，到相應的環境和地區去採集樣品。 M*8Ef^-U`t
（一）根據土壤特點 8_8 R$ =V
1．土壤有機質含量和通氣狀況 &'c1"%*%8>
一般耕作土、菜園土和近郊土壤中有機質含量豐富，營養充足，且土壤成團粒結構，通氣飽水性能好，因而，微生物生長旺盛，數量多，尤其適合於細菌、放線菌生長。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落葉多，有機質豐富，且陰暗潮濕，適合黴菌、酵母菌生長繁殖，微生物數量相應也比較少。 VCNg`6!x
從土層的縱剖面看，1～5cm的表層土由於陽光照射，蒸發量大，水分少，且有紫外線的殺菌作用，因而微生物數量比5～25cm土層少；25cm以下土層則因土質緊密，空氣量不足，養分與水分缺乏，含菌量也逐步減少。因此，采土樣最好的土層是5～25cm。一般每克土中含菌數約幾十萬到幾十億個，並且各種類型的細菌和放線菌幾乎都能分離到。如好氣芽孢桿菌、假單胞菌、短桿菌、大腸桿菌、某些嫌氣菌等。但總的說來酵母菌分布土層最淺，約5～10cm，黴菌和好氧芽孢桿菌也分布在淺土層。 \@GA;~x.b
2.土壤酸鹼度和植被狀況 -fT]}T6=
土壤酸鹼度會影響微生物種類的分布。偏鹼的土壤（pH7.0～7.5）環境，適合於細菌、放線菌生長。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）環境下，黴菌、酵母菌生長旺盛。由於植物根部的分泌物有所不同，因此，植被對微生物分布也有一定的影響。如番茄地或腐爛番茄堆積處有較多維生素C生產菌。葡萄或其他果樹在果實成熟時，其根部附近土壤中酵母菌數量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌數量比其他植被下占優勢。 m:)v>vu
3．地理條件 bh3}[O,L A
南方土壤比北方土壤中的微生物數量和種類都要多，特別是熱帶和亞熱帶地區的土壤。許多工業微生物菌種，如抗生素產生菌，尤其是黴菌、酵母菌，大多從南方土壤中篩選出來。原因是南方溫度高，溫暖季節長，雨水多，相對濕度高，植物種類多，植被覆蓋面大，土壤有機質豐富，造成得天獨厚的微生物生長環境。 +0;6.PK
4．季節條件 75jq+O_:
不同季節微生物數量有明顯的變化，冬季溫度低，氣候乾燥，微生物生長緩慢，數量最少。到了春天隨著氣溫的升高，微生物生長旺盛，數量逐漸增加。但就南方來說，春季往往雨水多，土壤含水量高，通氣不良，即使有微生物所需的溫度、濕度，也不利於其生長繁殖。隨後經過夏季到秋季，約有7～10個月處在較高的溫度和豐富的植被下，土壤中微生物數量比任何時候都多，因此，秋季采土樣最為理想。 /3L1Un*
（二）采樣方法 zVd2kuI&?
用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5～25處的土樣10～25，裝入事先准備好的塑料袋內紮好。北方土壤乾燥，可在10～30處取樣。給塑料袋編號並記錄地點、土壤質地、植被名稱、時間及其他環境條件。一般樣品取回後應馬上分離，以免微生物死亡。但有時樣品較多，或到外地取樣，路途遙遠，難以做到及時分離，則可事先用選擇性培養基做好試管斜面，隨身帶走。到一處將取好的土樣混勻，取3～4撒到試管斜面上，這樣可避免菌株因不能及時分離而死亡。 &Op, ?\
二．根據微生物生理特點采樣 w byY? tH
1.根據微生物營養類型 %r=uS.+hrF
每種微生物對碳\氮源的需求不一樣,分布也有差異。研究表明，微生物的營養需求和代謝類型與其生長環境有著很大的相關性。如森林土有相當多枯枝落葉和腐爛的木頭等，富含纖維素，適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產生菌生長；在肉類加工廠附近和飯店排水溝的污水、污泥中，由於有大量腐肉、豆類、脂肪類存在，因而，在此處采樣能分離到蛋白酶和脂肪酶的產生菌；在麵粉加工廠、糕點廠、酒廠及澱粉加工廠等場所，容易分離到產生蛋白酶、糖化酶的菌株。若要篩選以糖質為原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜餞、甜果及含糖濃度高的植物汁液中采樣。在篩選果膠酶產生菌時，由於柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有較多的果膠，因此，從上述樣品的腐爛部分及果園土中采樣較好。若需要篩選代謝合成某種化合物的微生物，從大量使用、生產或處理這種化合物的工廠附近採集樣品，容易得到滿意的結果。在油田附近的土壤中就容易篩選到利用碳氫化合物為碳源的菌株。Hartman等人曾從乙烯氯化物的工廠附近分離到一株以乙烯氯化物為碳源和能源的分枝桿菌。含1%乙烯氯化物的空氣通過該菌培養可除去93%的毒性。也有人從含油污泥中篩選出能以20#機械潤滑油為惟一碳源的3株石油降解菌菌株，分別為動膠菌屬（Zoogloea sp.）、氮單胞菌屬（Azomonas sp.）和假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。當然，也可將一種需要降解的物質作為樣品中微生物的惟一碳源或氮源進行富集，然後分離篩選。 X2}\i5{
此外，不少微生物對碳源的利用是不完全專一的，如以油脂為碳源的某些脂肪酶產生菌同樣也可以分解澱粉或其他糖類物質獲得能源而生長。以石油等碳氫化合物為碳源的油田微生物，也可以利用一些糖類為碳源。具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他樣品中也會存在。不過數量較少。 \ ExM.T
2.根據微生物的生理特性 w-C ~ Ik
在篩選一些具有特殊性質的微生物時，需根據該微生物獨特的生理特性到相應的地點采樣。如篩選高溫酶產生菌時，通常到溫度較高的南方，或溫泉、火山爆發處及北方的堆肥中採集樣品；分離低溫酶產生菌時可到寒冷的地方，如南北極地區、冰窖、深海中采樣；分離耐壓菌則通常到海洋底部采樣。因為深海中生活的微生物能耐很高的靜水壓，如從海中篩到一株水活微球菌（Micrococcus aquivivus）,它能在600個大氣壓下生長。分離耐高滲透壓酵母菌時，由於其偏愛糖分高、酸性的環境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜餞或甘蔗渣堆積處采樣。如有人曾在花蜜中分離到一株能耐30%高糖的耐高滲透壓的酵母菌。 AE={P*g
三、特殊環境下采樣 @{iws@.
1．局部環境條件的影響 jr bEJ.
值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和環境條件綜合因素的影響之外，還要受局部環境條件的影響。如北方氣候寒冷，年平均溫度低，高溫微生物相對較少。但在該地區的溫泉或堆肥中，卻會出現為數眾多的高溫微生物。氧氣充足的土層中按理只適合於好氧菌生長，實際上也有一些嫌氣菌生活，原因是好氣菌生長繁殖消耗了土層中大量氧氣，為嫌氣菌創造了局部生長的有利環境，故一般土壤中也能分離到嫌氣菌。 X/ gIH/
海洋對於微生物來說是一個特殊的局部環境，盡管許多微生物也是經河水、污水、雨水或塵埃等途徑而來，但由於海洋獨特的高鹽度、高壓力、低溫及光照條件，使海洋微生物具備特殊的生理活性，相應也產生了一些不同於陸地來源的特殊產物。前蘇聯學者發現，20%～50%的海鞘、海參體內的微生物可產生具有細菌毒性和殺菌活性的化合物。此外，美國馬里蘭大學也曾從海綿體內的共生或共棲的細菌中分離到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物質。日本發現深海魚類腸道內的嗜壓古細菌，80%以上的菌株可以生產EPA 和DHA，最高產量可達36%和24%。筆者從鱈魚腸道中分離到一株pj20細菌，產EPA14.78mg/L，在15℃培養時EPA占脂肪酸的12.7%。日本也從海洋Thraustochvtrium aureum中篩選到一株產DNA達290mg/L的菌株。從海洋中采樣時，可參考其中不同種類微生物的分布規律：表層多為好氣異養菌，底層由於有機質豐富，硫化氫含量高，厭氣性腐敗菌和硫酸鹽還原菌較多，兩層中則多為紫硫菌。 u_;*Ay
具有特殊性質的微生物通常分布在一些特殊的環境中。如得克薩斯州中南部的一個岩洞中存在著大量嗜鹼性的，能進行氨氧化和產幾丁質酶的微生物，其原因是這里生活這2000萬只蝙蝠，它們每晚吃釣5萬lb（磅）昆蟲，其排泄物造成了洞內0m深的豐富營養層，這種特殊的環境對該種微生物起了選擇和富集的作用。還有人從侵蝕木船的一種蠕蟲腸道中分離到既能固氮又能降解纖維素的微生物。從考拉(Koala)熊腸中也曾分離到萜烯分解酶的產生菌，這可能因為考拉專吃含有高萜烯的桉樹類植物，給該種微生物創造了一個適宜的生長環境。美國從用硝酸處理過的花生殼中分離到一株節桿菌，該菌以木質素為唯一碳源，它對處理過的花生殼的消化率可達到63%，再加入釀酒酵母使其蛋白質含量達到13.6%，可作為牛、豬、雞飼料的添加劑。 |NJe4lw+?
2．極端環境條件的影響 MqGF~h|+
微生物一般在中溫、中性pH條件下生長。但在絕大多數微生物所不能生長的高溫、低溫、高酸、高鹼、高鹽或高輻射強度的環境下，也有少數微生物存在，這類微生物被稱為極端微生物。生活所處的特殊環境，導致它們具有不同與一般微生物的遺傳特性、特殊結構和生理機能，因而在冶金、采礦及生產特殊酶制劑方面有著巨大的應用價值。 Z.a m^Q^Y!
嗜冷菌（thermophiles）的最適生長溫度為15℃，在0℃也可生長繁殖，最高溫度不超過20℃。主要分布於寒冷的環境中，如南北兩極地區、冰窟、高山、深海和土壤等低溫環境中。這類微生物在低溫發酵時可生產許多風味食品且可節約能源及減少中溫菌的污染。最適生長pH在8.0以上，通常在pH9～10之間的微生物，稱之為嗜鹼菌（alkaliphiles）。大量不同類型的嗜鹼菌已經從土壤、鹼湖、鹼性泉甚至海洋中分離得到。由於大部分鹼湖伴有高鹽，許多嗜鹼菌同時也是嗜鹽菌。該類菌所產生的酶如耐鹼蛋白酶和鹼性纖維素酶可作為洗滌劑的舔加成分，也可將鹼性澱粉酶用於紡織品工業。嗜鹼菌中的基因還可以用來調節其他細菌中基因產物的表達和分泌。嗜熱微生物是嗜熱菌最好的來源。有人從溫泉和海底火山口分離出了極端嗜熱菌。從義大利境內的噴硫磺氣的火山口中分離到一種原始的微生物，在pH2和90℃時生長最好，其代謝類型極不尋常，既能作為耗氧型自養菌將硫氧化成硫酸，使自己增殖，又能作為厭氧菌用氫還原硫，生成H2S。 l=8)_z;~D
第二節 含微生物樣品的富集培養 $#2ik~]>
富集（enrichment）培養是在目的微生物含量較少時，根據微生物的生理特點，設計一種選擇性培養基，創造有利的生長條件，使目的微生物在最適的環境下迅速地生長繁殖，數量增加，由原來自然條件下的劣勢種變成人工環境下的優勢種，以利分離到所需要的菌株。 v_)a=I%o&2
富集培養主要根據微生物的碳、氮源、pH、溫度、需氧等生理因素加以控制。一般可從以下幾個方面來進行富集。 ;Z HKTOoK
一、控制培養基的營養成分 )67_ yHW
微生物的代謝類型十分豐富，其分布狀態隨環境條件的不同而異。如果環境中含有較多某種物質，則其中能分解利用該物質的微生物也較多。因此，在分離該類菌株之前，可在增殖培養基中人為加入相應的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的營養而迅速繁殖，其他微生物則由於不能分解這些物質，生長受到抑制。當然，能在該種培養基上生長的微生物並非單一菌株，而是營養類型相同的微生物群。富集培養基的選擇性只是相對的，它只是微生物分離中的一個步驟。 sDT(3{)L7
現舉兩例，如要分離水解酶產生菌，可在富集培養基中以相應底物為惟一碳源，加入含菌樣品，給目的微生物以最佳的培養條件（pH、溫度、營養、通氣等）進行培養。能分解利用該底物的菌類得以繁殖，而其他微生物則因得不到碳源無法生長，菌數逐漸減少。此時分離將得到所需的微生物。又如要分離耐高滲酵母菌，由於該類菌在一般樣品中含量很少，富集培養基和培養條件必須嚴密設計。首先要到含糖分高的花蜜、糖質中去取樣。富集培養基為5%～6%的麥牙汁，30%～40%葡萄糖，pH3～4，在20～25℃溫度下進行培養，可以達到富集的目的。 , mEFp_a+
在富集培養時，還需根據微生物的不同種類選用相應的富集培養基，如澱粉瓊脂培養基通常用於絲狀真菌的增殖，配方為（%）：可溶性澱粉4，酵母浸膏0.5，瓊脂2，pH6.5～7.0。在配製時要特別注意酵母浸膏加量，過多會刺激菌絲生長，而不利於孢子的產生。 Y:[W wX|
根據微生物對環境因子的耐受范圍具有可塑性的特點，可通過連續富集培養的方法分離降解高濃度污染物的環保菌。如以苯胺作惟一碳源對樣品進行富集培養，待底物完全降解後，再以一定接種量轉接到新鮮的含苯胺的富集培養液中，如此連續移接培養數次。同時將苯胺濃度逐步提高，便可得到降解苯胺占優勢的菌株培養液，採用稀釋塗布法或平板劃線法進一步分離，即可得到能降解高濃度苯胺的微生物。移種的時間既可根據底物的降解情況，也可通過微生物的生長情況確定。如在分離環己烷降解菌時，樣品經環己烷為惟一碳源的培養基富集後，培養液由原來的無色變為渾濁的乳白色。同時錐行瓶壁上也可觀察到微生物的生長情況。此時可以2%的接種量移入新鮮的富集培養基中繼續培養。連續富集培養的方法雖耗時較長，有時甚至需要6～7個月，但效果較好。通過該方法分離DDT、甲基對硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌，也都取得了滿意的結果。 W6ZXb_ X
二、控制培養條件 OSk:njyC[
在篩選某些微生物時，除通過培養基營養成分的選擇外，還可通過它們對pH、溫度及通氣量等其他一些條件的特殊要求加以控制培養，達到有效的分離目的。如細菌、放線菌的生長繁殖一般要求偏鹼（7.0～7.5），黴菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）。因此，富集培養基的pH值調節到被分離微生物的要求范圍不僅有利於自身生長，也可排除一部分不需要的菌類。 P1;T- .X~&
分離放線菌時，可將樣品液在40℃恆溫預處理20分鍾，有利於孢子的萌發，可以較大的增加放線菌數目，達到富集的目的。 ,cPNZ-%
篩選極端微生物時，需針對其特殊的生理特性，設計適宜的培養條件，達到富集的目的。 3p{N7/z(
一般所篩選的微生物通常是好氧菌，但有時也需分離厭氧菌。因嚴格厭氧菌不僅可省略通氣、攪拌裝置，還可節省能耗。這時除了配置特殊的培養基外，還需准備特殊的培養裝置，創造一個有利於厭氧菌的生長環境，使其數量增加，易於分離。 WJ=DTO N
三、抑制不需要的菌類 vA@K b3 ,
在分離篩選的過程中，除了通過控制營養和培養條件，增加富集微生物的數量以有利於分離外，還可通過高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物的數量，使目的微生物的比例增加，同樣能夠達到富集的目的。 Kdh(vNB>
從土壤中分離芽孢桿菌時，由於芽孢具有耐高溫特性，100℃很難殺死，要在121℃才能徹底死亡。可先將土樣加熱到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h，殺死不產芽孢的菌種後再進行分離。在富集培養基中加入適量的膽鹽和十二烷基磺酸鈉可抑製革蘭陽性菌的生長，對革蘭陰性無抑製作。分離厭氧菌時，可加入少量硫乙醇酸鈉作為還原劑，它能使培養基氧化還原電勢下降，造成缺氧環境，有利於厭氧菌的生長繁殖。 9+"D8 J7
篩選黴菌時，可在培養基中加入四環素等抗生素抑制細菌，使黴菌在樣品的比例提高，從中便於分離到所需的菌株；分離放線菌時，在樣品懸浮液中加入10滴10%的酚或加青黴素（抑制G+菌）、鏈黴素（抑制G-菌）各30～50U/ml，以及丙酸鈉10μg/ml（抑制黴菌類）抑制黴菌和細菌的生長。另外據報道，重鉻酸鉀對土壤真菌、細菌有明顯的抑製作用，也可用於選擇分離放線菌。在分離除鏈黴菌以外的放線菌時，先將土樣在空氣中乾燥，再加熱到100℃保溫1h，可減少細菌和鏈黴菌的數量。分離耐高濃度酒精和高滲酵母菌時，可分別將樣品在高濃度酒精和高濃度蔗糖溶液中處理一段時間，殺死非目的微生物後再進行分離。 LO]D XW 9
對於含菌數量較少的樣品或分離一些稀有微生物時，採用富集培養以提高分離工作效率是十分必要的。但是如果按通常分離方法，在培養基平板上能出現足夠數量的目的微生物，則不必進行富集培養，直接分離、純化即可。 3{RuR+yi
第三節 微生物的分離 }uo5rB5D
經富集培養以後的樣品，目的微生物得到增殖，佔了優勢，其他種類的微生物在數量上相對減少，但並未死亡。富集後的培養液中仍然有多種微生物混雜在一起，即使佔了優勢的一類微生物中，也並非純種。例如同樣一群以油脂為碳源的脂肪酶產生菌，有的是細菌，有的是黴菌，有的是芽孢桿菌，有的不產芽孢，有的生產能力強，有的生產能力弱等等。因此，經過富集培養後的樣品，也需要進一步通過分離純化，把最需要的菌株直接從樣品中分離出來。 Mm`jk%:%]
Ⅵ 選擇性分離微生物育種的步驟大致有哪些
一、微生物工業對菌種的要求
(一)、微生物工業的生產水平由三個要素決定：生產菌種的性能、發酵及提純工藝條件、生產設備。其中生產菌種的性能是最重要的因素。
（二）、微生物工業對菌種的要求是：
（1）菌株高產，在較短的時間內發酵產生大量發酵產物的能力;
（2）在發酵過程中不產生或少產生與目標產品相近的副產品及其他產物;
（3）生長繁殖能力強，較強的生長速率，產孢子的菌種應該具有較強的產孢子能力;
（4）能夠高效地將原理轉化為產品;
（5）能利用廣泛的原材料，並對發酵原料成分的波動敏感性小;
（6）對需要添加的前體物質有耐受能力，並且不能將這些前體物質作為一般碳源利用;
（7）在發酵過程中產生的泡沫要少;
（8）具有抗噬菌體的能力；
（9）遺傳穩定性，
二、工業用微生物菌種的來源及選育
（一）微生物菌種的來源
一般通過以下幾個途徑收集菌種、採集樣品和分離篩選：
（1）是根據資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；
（2）從大自然中採集樣品分離；
（3）從一些發酵製品中分離篩選目的菌株。
當前發酵工業所用菌種總趨勢是從野生菌轉向變異菌，自然選用轉向代謝育種，從誘發基因突變轉向基因重組的定向育種。
（二）微生物工業菌種的分離
1、野生菌株的分離、篩選過程
（1）新菌種分離與篩選的步驟
菌種分離的流程如下：
標本採集 →標本材料的預處理→富集培養→菌種初篩→ 菌種復篩→性能鑒定→ 菌種保藏
①采樣
采樣季節：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。
采土方式：在選好適當地點後，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，紮好，標記，記錄采樣時間、地點、環境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。
②標本預處理
④純種分離：採用劃線分離法、稀釋分離法等純化方法獲取單菌落。
⑤高產菌株的篩選：這一步是採用與生產相近的培養基和培養條件，通過三角瓶的容量進行小型發酵試驗，獲得適合於工業生產用菌種。還要對菌種進行發酵性能測定，
⑥毒性試驗：據有的國家規定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑麴黴、米麴黴和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。
2、菌種的分離方法
（1）施加選擇性壓力分離法
主要是利用不同種類的微生物其生長繁殖對環境和營養的要求不同，如溫度、pH、滲透壓、氧氣、碳源、氮源等，人為控制這些條件，使之利於某類或某種微生物生長，而不利於其他種類微生物的生存，以達到使目的菌種占優勢．而得以快速分離純化的目的。如可以控制培養時的氧，可將好氧微生物和厭氧微生物分開；通過控制溫度，可將嗜熱微生物和非嗜熱微生物分開；控制pH，可將嗜酸、嗜鹼微生物分離等。在分離培養基中也可以加入不同的抗生素或試劑來增加選擇性。如在分離放線菌和細菌時，可加入抗真菌抗生素；分離真菌時，可加入抗細菌葯物。
（2）隨機分離方法
有些微生物的產物對篩選沒有直接的選擇性指示作用，因此常採用隨機分離方法分離。
A、抗生素產生菌的分離
抗生素產生菌的分離常用抑菌圈法。實驗必須用工具菌：採用抗生素的敏感菌，傳統上常用金黃色葡萄球菌和枯草桿菌。
Ｂ、抗腫瘤葯物產生菌的分離
抗腫瘤葯物產生菌的分離常用方法：生化誘導法、SOS生色檢測法、DNA修復能力突變株。原理是利用DNA的損傷，微生物發生突變。
B1、生化誘導法：將大腸桿菌的lacZ基因連接在λ噬菌體的PL啟動子下，當DNA損傷時，誘發λ阻遏物CI分解，PL啟動子啟動lacZ基因轉錄，測定表達的ß-半乳糖苷酶活性，來檢測葯物的存在。
B2、SOS生色檢測法：利用當DNA損傷時，可活化yecA蛋白，進而分解噬菌體的阻遏蛋白，再引起sifA基因啟動lacZ基因轉錄，測定表達的ß-半乳糖苷酶活性，來檢測葯物的存在。
Ｃ、生長因子產生菌的分離
以氨基酸產生菌為例，介紹篩選方法。首先將待試菌接入加了抗真菌的化合物（如亞胺環己酮）的分離培養基中生長，然後採用影印法，將菌落復印到能支持氨基酸產生菌生長的培養基中。
Ⅶ 工業微生物菌株的來源途徑主要有哪些、
（1）向菌種保藏機構索取有關的菌株，從中篩選所需菌株。
（2）由自然界採集樣品，如土壤、水、動植物體等，從中進行分離篩選。
（3）從一些發酵製品中分離目的菌株，如從醬油中分離蛋白酶產生菌，從酒醪中分離澱粉酶或糖化酶的產生菌等。該類發酵製品經過長期的自然選擇，具有悠久的歷史，從這些傳統產品中容易篩選到理想的菌株。
Ⅷ 任選一種感興趣的重要工業微生物發酵產品，利用已學的理論知識，試述該生產菌株的篩選方案。幫幫忙，謝謝
選一種你感興趣的微生物，比如說分解石油的，或者能源微生物等，以分解石油的為例，
首先：自然篩選，從石油污染的水源或者不同石油濃度培養的微生物中分離，篩選。查找資料，看看那種微生物可能分解石油，是細菌，桿菌，黴菌還是什麼，有針對性地根據微生物的大小，培養特點，抗性等分離得到基礎分解石油的微生物，在培養基上進行但菌落的分離
之後：建立行之有效的檢測機制，例如可以以石油分解率為指標等
第三：誘變育種，將上述基礎微生物進行誘變，可採用化學誘變，放射性誘變等方法，之後挑取每一個單菌落進行檢測
第四：基因育種，通過查找文獻的方法找到控制分解石油的基因進行分子克隆重組，如果沒有該功能基因的報道，亦可以自己分離，方法是採用SSH等表達差異分析方法，找到你誘變出來的優秀菌株與突變菌株的差異基因片段，分析該差異基因片段的可能功能，找出可能的功能基因，同樣進行表達載體的構建，轉化基礎菌株，看看是否能夠提高分解速度
第五：代謝調控育種：根據分解石油可能的代謝網路，加入抑制劑等打斷該菌其他的代謝途徑，促進分解石油的代謝途徑，同時研究最佳的分解石油的溫度，PH，所需離子等條件
我不是專業的，你大致的看一下，希望有幫助
Ⅸ 論述從環境中篩選目標菌中的方法，一種就可以，詳細點
5.6 菌種篩選方法
所有的微生物育種工作都離不開菌種篩選。尤其是在誘變育種工作中，篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟。經誘變處理後，突變細胞只佔存活細胞的百分之幾，而能使生產狀況提高的細胞又只是突變細胞中的少數。要在大量的細胞中尋找真正需要的細胞，就象是大海撈針，工作量很大。簡潔而有效的篩選方法無疑是育種工作成功的關鍵。 為了花費最少的工作量，在最短的時間內取得最大的篩選成效，就要求採用效率較高的科學篩選方案和手段。因為誘變育種中的篩選工作最復雜，所以，本節主要討論誘變育種的篩選方法，這些方法也為其它育種方法的篩選提供了借鑒。
5.6.1菌種篩選方案 在實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復篩兩步進行。初篩的目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產性狀類似的菌株盡量保留下來，使優良菌種不致於漏網。因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次。初篩的手段應盡可能快速、簡單。復篩的目的是確認符合生產要求的菌株，所以，復篩步驟以質為主，應精確測定每個菌株的生產指標。
5.6.2 菌種篩選的手段 篩選的手段必需配合不同篩選階段的要求，對於初篩，要力求快速、簡便，對於復篩，應該做到精確，測得的數據要能夠反映將來的生產水平。
5.6.2.1 從菌體形態變異分析 有時，有些菌體的形態變異與產量的變異存在著一定的相關性，這就能很容易地將變異菌株篩選出來。盡管相當多的突變菌株並不存在這種相關性，但是在篩選工作中應盡可能捕捉、利用這些直接的形態特徵性變化。當然，這種鑒別方法只能用於初篩。有人曾統計過3,484個產維生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的變異菌落，發現高產菌株的菌落形態有以下特點：菌落直徑呈中等大小（8-10毫米），凡過大或過小者均為低產菌株；色澤深黃色，凡淺黃或白色者皆屬低產菌株。又如，在灰黃黴素產生菌蕁麻青黴(Penicillium urticae)的育種中，曾發現菌落的棕紅色變深者往往產量有所提高，而在赤黴素生產菌藤倉赤霉（Gibberella fujikuroi）中，卻發現菌落的紫色加深者產量反而下降。
5.6.2.2 平皿快速檢測法 平皿快速檢測法是利用菌體在特定固體培養基平板上的生理生化反應，將肉眼觀察不到的產量性狀轉化成可見的"形態"變化。具體的有紙片培養顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等，見圖5.6.1。這些方法較粗放，一般只能定性或半定量用，常只用於初篩，但它們可以大大提高篩選的效率。它的缺點是由於培養平皿上種種條件與搖瓶培養，尤其是發酵罐深層液體培養時的條件有很大的差別，有時會造成兩者的結果不一致。 圖 5.6.1 平皿快速檢測法示意圖 平皿快速檢測法操作時應將培養的菌體充分分散，形成單菌落，以避免多菌落混雜一起，引起"形態"大小測定的偏差。
1) 紙片培養顯色法 將飽浸含某種指示劑的固體培養基的濾紙片擱於培養皿中，用牛津杯架空，下放小團浸有3%甘油的脫脂棉以保濕，將待篩選的菌懸液稀釋後接種到濾紙上，保溫培養形成分散的單菌落，菌落周圍將會產生對應的顏色變化。從指示劑變色圈與菌落直徑之比可以了解菌株的相對產量性狀。指示劑可以是酸鹼指示劑也可以是能與特定產物反應產生顏色的化合物。
2) 變色圈法 將指示劑直接摻入固體培養基中，進行待篩選菌懸液的單菌落培養，或噴灑在已培養成分散單菌落的固體培養基表面，在菌落周圍形成變色圈。如在含澱粉的平皿中塗布一定濃度的產澱粉酶菌株的菌懸液，使其呈單菌落，然後噴上稀碘液，發生顯色反應。變色圈越大，說明菌落產酶的能力越強。而從變色圈的顏色又可粗略判斷水解產物的情況。
3) 透明圈法 在固體培養基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養成分，造成渾濁、不透明的培養基背景。將待篩選在菌落周圍就會形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物質的能力。 在培養基中摻入可溶性澱粉、酪素或CaCO3可以分別用於檢測菌株產澱粉酶、產蛋白酶或產酸能力的大小。
4) 生長圈法 利用一些有特別營養要求的微生物作為工具菌，若待分離的菌在缺乏上述營養物的條件下，能合成該營養物，或能分泌酶將該營養物的前體轉化成營養物，那麼，在這些菌的周圍就會有工具菌生長，形成環繞菌落生長的生長圈。 該法常用來選育氨基酸、核苷酸和維生素的生產菌。工具菌往往都是對應的營養缺陷型菌株。
5) 抑制圈法 待篩選的菌株能分泌產生某些能抑制工具菌生長的物質，或能分泌某種酶並將無毒的物質水解成對工具菌有毒的物質，從而在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈。例如：將培養後的單菌落連同周圍的小塊瓊脂用穿孔器取出，以避免其它因素干擾，移入無培養基平皿，繼續培養4-5天，使抑制物積累，此時的抑制物難以滲透到其它地方，再將其移入塗布有工具菌的平板，每個瓊脂塊中心間隔距離為2厘米，培養過夜後，即會出現抑菌圈。抑菌圈的大小反映了瓊脂塊中積累的抑制物的濃度高低。該法常用於抗生素產生菌的篩選，工具菌常是抗生素敏感菌。由於抗生素分泌處於微生物生長後期，取出瓊脂塊可以避免各菌落所產生抗生素的相互干擾。典型的例子是春雷黴素生產菌的篩選，見圖5.6.2。
5.6.2.3 搖瓶培養法 搖瓶培養法是將待測菌株的單菌落分別接種到三角瓶培養液中，振盪培養，然後，再對培養液進行分析測定。搖瓶與發酵罐的條件較為接近，所測得的數據就更有實際意義。但是搖瓶培養法需要較多的勞力、設備和時間，所以，搖瓶培養法常用於復篩。但若某些突變性狀無法用簡便的形態觀察或平皿快速檢測法等方法檢測時，搖瓶培養法也可用於初篩。 初篩的搖瓶培養一般是一個菌株只做一次發酵測定，從大量菌株中選出10-20%較好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而復篩中搖瓶培養一般是一個菌株培養3瓶，選出3-5個較好的菌株，再做進一步比較，選出最佳的菌株。
5.6.3 特殊變異菌的篩選方法 上述一般的篩選菌株方法的處理量仍是很大的，為了從存活的每毫升106左右細胞的菌懸液中篩選出幾株高產菌株，要進行大量的稀釋分離、搖瓶和測定工作。雖然平皿快速檢測法作為初篩手段可減少搖瓶和測定的工作量，但稀釋分離的工作仍然非常繁重。而且有些高產變異的頻率很低，在幾百個單細胞中並不一定能篩選到，所以，建立特殊的篩選方法是極其重要的。例如營養缺陷型和抗性突變菌株的篩選有它們的特殊性，營養缺陷型或抗性突變的性狀就象一個高效分離的"篩子"，以它為篩選的條件，可以大大加快篩選的進程並有效地防止漏篩。在現代的育種中，常有意以它們作為遺傳標記選擇親本或在DNA中設置含這些遺傳標記的片段，使菌種篩選工作更具方向性和預見性。本節還將簡單介紹其它一些特殊變異株的篩選方法。
5.6.3.1營養缺陷型突變株的篩選 經誘變處理後的菌懸液在篩選前一般應先進行誘變後培養，以促使變異細胞發生分離，防止出現表型延遲現象，篩選出不純的菌株。營養缺陷型的篩選一般包括濃縮、進一步檢出和鑒別營養缺陷型等步驟。
1) 濃縮營養缺陷型菌株 誘變後的細胞群體中大部分存活菌是野生型，而營養缺陷型占的比例相當小，這對分離是很不利的，所以，應該淘汰大量的野生型，以達到濃縮營養缺陷型的目的。常用的濃縮方法有抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和飢餓法等。
2)進一步檢出所需缺陷型 濃縮後的菌液中營養缺陷型的比例較大，但並非全部都是。並且營養缺陷型中也有不同的類型，還需要進一步檢出所需要的營養缺陷型。這樣就需要採用逐個檢出法、夾層培養法和限量補給法等方法進一步檢出所需要的營養缺陷型。
3)營養缺陷型的鑒定 獲得的營養缺陷型菌株還應進一步確認其生長的所需物。菌株較少時，可用生長譜法， 若菌株較多時，常採用組合補充培養基法
5.6.3.2 抗性突變菌株的篩選 抗性突變株的篩選相對比較容易，只要有10-6頻率的突變體存在，就容易篩選出來。抗性突變株的篩選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段。
1) 一次性篩選法 一次性篩選法就是指在對出發菌株完全致死的環境中，一次性篩選出少量抗性變異株。 噬菌體抗性菌株常用此方法篩選。將對噬菌體敏感的出發菌株經變異處理後的菌懸液大量接入含有噬菌體的培養液中，為了保證敏感菌不能存活，可使噬菌體數大於菌體細胞數。此時出發菌株全部死亡，只有變異產生的抗噬菌體突變株能在這樣的環境中不被裂解而繼續生長繁殖。通過平板分離即可得到純的抗性變異株。 耐高溫菌株在工業發酵中的應用意義在於它可以節約冷卻水的用量，尤其是在夏季，並能減少染菌的機會。耐高溫菌株所產生酶的熱穩定性較高，適用於一些特殊的工藝過程。耐高溫菌株也常採用此法篩選。將處理過的菌懸液在一定高溫下處理一段時間後再分離。對此溫度敏感的細胞被大量殺死，殘存的細胞則對高溫有較好的耐受性。 耐高濃度酒精的酵母菌的酒精發酵能力較高，也適宜提高發酵醪濃度，提高醪液酒精濃度。而耐高滲透壓的酵母菌株具有積累甘油的性能，可用於甘油發酵。耐高酒精度、高滲透壓的菌株也可分別在高濃度酒精或加蔗糖等造成的高滲環境下一次性篩選獲得。
2)階梯性篩選法 葯物抗性即抗葯性突變株可在培養基中加入一定量的葯物或對菌體生長有抑製作用的代謝物結構類似物來一次性篩選，大量細胞中少數抗性菌在這種培養基平板上能長出菌落。但是在相當多的情況下，無法知道微生物究竟能耐受多少高濃度的葯物，這時，葯物抗性突變株的篩選需要應用階梯性篩選法。 因為葯物抗性常受多位點基因的控制，所以葯物的抗性變異也是逐步發展的，時間上是漸進的，先是可以抗較低濃度的葯物，而對高濃度葯物敏感，經"馴化"或誘變處理後，可能成為抗較高濃度葯物的突變株。階梯篩選法由梯度平板或紙片擴散在培養皿的空間中造成葯物的濃度梯度，可以篩選到耐葯濃度不等的抗性變異菌株，使暫時耐葯性不高，但有發展前途的菌株不致於被遺漏，所以說，階梯性篩選法較適合於葯物抗性菌株的篩選，特別是在暫時無法確定微生物可以接受的葯物濃度情況下
5.6.3.3 組成酶變異株的篩選
許多水解酶是誘導酶，只有在含有底物或底物類似物的培養環境中，微生物才會合成這些酶類，所以，誘導酶的生產不僅需要誘導物，而且受到誘導物的種類、數量以及分解產物的影響。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）往往會引起酶合成的減少，誘導物有時又比較昂貴。這些都可能造成這些水解酶工業生產的波動以及生產成本提高。如果控制這些酶合成的調節基因發生了變異，誘導酶就可能轉變成組成酶，它的合成與細胞的其它組織蛋白一樣，不再需要誘導物的存在。由誘導型的出發菌株誘變篩選出組成型變異株對於水解酶的工業生產具有重要的現實意義。具體的篩選方法有恆化器法、循環培養法和誘導抑制物法。
1) 恆化器法 恆化器常被用於微生物的"馴化"。在培養基中添加不能起誘導作用的低濃度底物，接入處理後的菌懸液進行培養，此時出發菌株由於不能被誘導，無法合成有關的誘導酶而不能分解該底物，從而生長速率極慢，而群體中少數組成型變異株則可合成有關的酶，分解利用該底物，生長速率較快。為了提高組成酶變異株的優勢，即它在群體中的比例，可以應用恆化器培養技術。隨著恆化器培養中不斷加入新鮮基質而逐漸增大組成酶變異株的優勢，這樣就能夠比較容易地做進一步的純化分離。
2) 循環培養法 利用不含誘導物的培養環境和含有誘導物的培養環境進行交替循環培養待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。當接種到不含誘導物而含有其它可利用碳源的培養基中時，兩種類型菌株同樣能較好地生長，但在此環境中組成型突變株已能合成有關的水解酶，而誘導型菌株就不能合成。 進而將它們轉接入含誘導物的培養基中時，變異株能迅速利用誘導底物進行生長繁殖，而誘導型出發菌株需經歷一個誘導合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步了，隨著循環交替培養的繼續，組成酶變異株所佔的比例將逐漸增大。
3) 誘導抑制劑法 有些化合物能阻止某些誘導酶的合成，如α-硝基苯基-β-岩藻糖苷對大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的誘導合成有抑製作用，稱為誘導抑制劑。當在誘導物和誘導抑制劑同時存在的培養環境中培養待分離菌群時，誘導型菌株不能產生誘導酶，無法正常生長，只有組成型變異株能夠利用底物進行生長繁殖。
5.6.3.4高分子廢棄物分解菌的篩選 隨著石油化工和塑料工業的發展，各種高分子包裝廢棄物日益增多，這些"白色污染"在自然界很難被消化而進入物質循環。設法選育能分解利用這些高分子材料的微生物對於環境保護至關重要。這些高分子材料大多是不溶於水的，直接分離具有分解功能的微生物很困難。為此，有人設計了階段式篩選法，首先尋找能在與聚乙二醇結構相似的含兩個醚鍵的三甘醇上生長的微生物，接著，誘變篩選能分解聚乙二醇的變異株；或者篩選能以乙二醇、丙二醇為碳源的菌株，繼而誘變篩選出能利用聚乙二醇等物質的變異株。這種由簡單的聚合物單體入手逐級篩選高分子廢棄物分解菌也許是一條有效的篩選思路。
5.6.3.5無泡沫菌株及高凝聚性菌株的篩選 有些菌在發酵過程中會產生大量的泡沫，從而造成發酵液滿溢，增大了染菌的機會，使發酵體系反應不均勻，也有可能引起某些發酵產物的生物活性喪失，如蛋白酶變性失活。為了避免泡沫的產生，常常需通過犧牲發酵液的裝量或加入大量的消泡劑來消除泡沫的不利影響。發酵過程產生泡沫是菌體代謝、培養基和發酵工藝等方面的原因造成的，而菌種是產生泡沫的關鍵，選育無泡沫或少泡沫菌株可以從根本上解決泡沫問題。 有人用氣泡上浮法篩選出了無泡沫的酒精酵母。將變異處理後的菌懸液接種入生長培養基中，培養器皿的底部放置無菌壓縮空氣噴口，培養過程中不斷通入無菌空氣，形成鼓泡，易產生泡沫的酵母菌會隨泡沫而除去，留下的是不易產生泡沫的變異菌株；也有人用苯胺藍染色法進行篩選，將經過變異處理的菌懸液經培養後塗布在含葡萄糖3%、酵母膏0.5%、苯胺藍0.005%的平板上培養4天，出發菌株呈淺藍色，變異菌株因細胞壁成分和結構改變造成與染料結合力改變，少泡沫的變異菌株呈深藍色。 啤酒發酵和單細胞蛋白培養都希望由凝聚性較好的酵母菌株擔任發酵菌種，以便於啤酒的澄清和保持良好的風味，以及單細胞蛋白的收集。採用上述的泡沫上浮法也可以除去不易凝聚的細胞，通過改變鼓泡速度的調節，可以獲得具不同凝聚性的菌株。